NAZIV PROJEKTA: Leukocitni metabolički biljezi u kroničnoj limfocitnoj leukemiji prostorno razlučeni slikovnom spektrometrijom masa

NOSITELJ PROJEKTA: KBC Osijek, J. Huttlera 4, 31 000 Osijek

IZVOR FINANCIRANJA: Hrvatska zaklada za znanost

Vrijednost projekta: 129,670.20 eura

VRSTA PROJEKTA: Istraživački projekti (IP-2022-10)

Trajanje projekta: 48 mjeseci – 31.12.2023. – 31.12.2027.

VODITELJ PROJEKTA: izv.prof.dr. Željko Debeljak, mag., spec. med. biokemije, v.d. Predstojnik Kliničkog zavoda za laboratorijsku dijagnostiku, Klinički bolnički centar Osijek

 

PROJEKTNI TIM

Znanstveni tim

izv.prof.dr. Željko Debeljak, mag., spec. med. biokemije

Doc.dr.sc. Dario Mandić, mag., spec. analitičke toksikologije

Dr.sc. Stefan Mrđenović, dr.med., spec. hematolog

Dr.sc. Barbara Vuković, mag., spec. med. biokemije i lab. medicine

Doc.dr.sc. Jasmina Rajc, dr.med., spec. patološke anatomije

Doc.dr.sc. Vatroslav Šerić, mag. spec. med. biokemije

Doc.dr.sc. Branka Lončar, dr.med., spec. kliničke citologije

Ivana Marković, mag., spec. med. biokemije i lab. medicine

Maja Lukić, mag., spec. med. biokemije i lab. medicine

Ana Kotris, dr.med., spec. hematolog

Administrativni tim

Dora Šmehil, mag.oec.

Damir Horvat, mag.oec.

 

Kontakt osoba: Dora Šmehil, mag. oec.

E-mail: dora.smehil@kbco.hr

Telefon: 031 511 055

 

SAŽETAK PROJEKTA

Uvod: Kronična limfocitna leukemija (KLL) je jedan od najčešćih tipova leukemije koji skraćuje preživljavanje i smanjuje kvalitetu života oboljelih te predstavlja značajan izazov za zdravstveni sustav. Uzroci kraćeg preživljavanja oboljelih najčešće su progresija KLL praćena pojavom anemije, krvarenja, tromocitopenije, neutropenije i pneumonija, izostanak odgovora na terapiju često korištenim lijekovima poput ibrutiniba te komplikacije terapije poput sindroma lize tumora. Iako je postavljanje dijagnoze KLL pouzdano, rano prepoznavanje progresije bolesti, izostanka odgovora na terapiju te navedenih komplikacija još je izvan dosega postojećih dijagnostičkih i prognostičkih postupaka koji su utemeljeni na anamnestičkim podacima, fizikalnom pregledu, citomorfološkim i citogenetičkim postupcima te imunofenotipizaciji. Progresija bolesti i navedene komplikacije su povezane s padom broja i gubitkom funkcije krvnih stanica te se očekuje da navedenim promjenama broja i funkcije prethode promjene u staničnom metabolizmu. Poznat je cijeli niz metaboličkih biljega povezanih s apoptozom, autofagijom, oksidativnim stresom te aktivacijom staničnog imunološkog odogovora. Dok su apoptoza, autofagija i oksidativni stres očekivani učinci terapije na maligni limfocitni klon prisutan u KLL ove pojave mogu biti predskazatelji anemije ili neutropenije i posljedične sepse ukoliko se pojave u granulocitima i drugim krvnim stanicama.

Slikovna spektrometrija masa (SSM) je nova laboratorijska tehnologija koja je tek tijekom proteklog desetljeća počela dobivati kliničko-dijagnostičke primjene, prvenstveno u histopatološkoj dijagnostici solidnih tumora: SSM pruža uvid u prostornu raspodjelu velikog broja različitih molekula, najčešće proteina i metabolita, u presjeku tkiva i organa. Kako su tek unazad nekoliko godina komercijalno dostupni uređaji za SSM s prostornom rezolucijom od 5 µm ili boljom, što odgovara promjeru najmanjih krvnih stanica, mogućnosti primjene ove tehnologije u citologiji, posebice u hematološkoj citologiji, još nisu ispitane. SSM pojedinačnih stanica omogućava relativnu kvantifikaciju različitih molekula prisutnih u odabranim stanicama i prostorno razlučivanje leukocitnih metabolita u krvnom preparatu. Za relativnu kvantifikaciju u SSM se koriste intenziteti signala odabranih molekula dobiveni snimanjem masenih spektara (MS) ili tandemskih masenih spektara (MS/MS) promatranih stanica. No, pomoću SSM se, na temelju omjera intenziteta odabranog signala i šuma, može utvrditi i broj te udio stanica određene loze, prisutnih u razmazu krvi ili krvnog pripravka, koje sadrže mjerljive količine metaboličkih biljega poput ceramida u slučaju apoptoze, poliamina u slučaju autofagije, neopterina u slučaju imunološke aktivacije i sl. Očekuje se da tako dobiveni udio stanica određene loze koje sadrže navedene metaboličke biljege reflektira učinak terapije ili vjerojatnost pojava komplikacija osnovne bolesti te može poslužiti kao predskazatelj odgovora na terapiju ili kao predskazatelj komplikacija

Hipoteza: Promjene sadržaja metaboličkih biljega u pojedinim leukocitnim lozama određene pomoću SSM koje prethode manifestnom smanjenju broja stanica su povezane s progresijom KLL, izostankom odgovora na monoterapiju ibrutinibom i njenim nuspojavama.

Ciljevi: Primarni cilj ovog znanstvenog projekta je prepoznavanje metaboličkih obrazaca pojedinih leukocitnih loza u KLL pomoću tehnologije SSM. Sekundarni cilj je odabir kandidata za prognostičku primjenu među leukocitnim metaboličkim biljezima statistički povezanim s progresijom KLL, nuspojavama liječenja ibrutinibom i izostankom njegova učinka.

Metode: Kako bi se ostvario primarni cilj potrebno je provesti pretklinička, analitičko-biokemijska istraživanja nakon čega će uslijediti klinička evaluacija povezanosti odabranih metaboličkih leukocitnih markera s tijekom i liječenjem KLL. Istraživanja uvjeta pripreme krvnog razmaza, izolata perifernih mononukleara i koncentrata leukocita zdravih ispitanika i osoba oboljelih od KLL u svrhu prilagođavanja zahtjevima snimanja SSM će prethoditi samim snimanjima spektara. Na temelju dobivenih masenih spekatara (MS) i tandemskih spektara (MS/MS) će biti utvrđeni oni metabolički biljezi čiji su signali u MS dovoljno reproducibilni za dijagnostičku ili prognostičku primjenu a čija je uloga u autofagiji, apoptozi i drugim relevantnim staničnim procesima dobro literaturno opisana. Identitet metabolita utvrđen na temelju usporedbe masa/naboj (m/z) signala iz MS i dostupnih baza podataka će biti potvrđen s MS/MS analizama, a po potrebi, će biti provedena evaluacija rezultata dobivenih SSM postupcima pomoću tekućinske kromatografije spregnute s tandemskom masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) ili imunokemijskim postupcima u staničnim lizatima. U podskupu metabolita koji imaju reproducibilne signale biti će izdvojeni oni metabolički biljezi koji su svojstveni određenim leukocitnim lozama u krvi netretiranih bolesnika. Uslijediti će klinička opservacijska istraživanja povezanosti promjena broja stanica određene loze koje ispoljavaju ciljane metaboličke biljege sa progresijom bolesti, povezanosti sa odgovorom na monoterapiju ibrutinibom te sa nuspojavama te terapije. Očekuje se da će promjene broja stanica koje ispoljavaju neke od ciljanih biljega biti povezane s pojavom simptoma i s terapijom te će time postati biljezi kandidati za prognostičku primjenu. U tu će svrhu biti regrutirano do120 bolesnika sa i bez terapije te će biti praćeni kroz period od 12 mjeseci kako bi se utvrdilo jesu li odabrani metabolički biljezi povezani s progresijom bolesti te s odgovorom na terapiju. U svrhu kliničke evaluacije povezanosti metaboličkih leukocitnih biljega s KLL će se provesti mjerenja rutinskih dijagnostičkih i prognostičkih pokazatelja poput serumske aktivnosti LDH, serumskog β2 mikroglobulina, zatim protočno-citometrijske analize apoptoze, autofagije i fagocitne aktivnosti granulocita te citogenetske analize čiji će rezultati poslužiti kao referentni podaci.

Zaključak: U slučaju uspješnog ostvarenja ciljeva, moguća prognostička primjena leukocitnih metaboličkih biljega prostorno razlučenih SSM u bolesnika s KLL bi smanjila neizvjesnost kako za bolesnika tako i za zdravstveni sustav jer bi omogućila pravovremeno pružanje primjerenih oblika liječenja. Ostvarivanje ciljeva podrazumjeva i pronalaženje kandidata za prognostičku primjenu iz grupe metaboličkih biljega povezanih s apoptozom i autofagijom što bi dalo novi uvid u patofiziologiju i farmakoterapiju KLL. Konačno, ostvarivanje ciljeva bi rezultiralo i pronalaženjem optimalnih preparativnih te instrumentalnih uvjeta potrebnih za analizu razmaza krvnih pripravaka primjenom tehnologije SSM što može naći primjenu u drugim hematološkim bolestima.